基因型

F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm lacY1 ahpC(DE3)gor522::Tn10 trxB pRARE (Camr, Kanr, Tetr)

簡(jiǎn)要說(shuō)明

Rosetta-gami B(DE3) 菌株聚合了BL21，Tuner，Origami和Rosetta 四種菌株的優(yōu)點(diǎn)： lacY1基因 (半乳糖苷透性酶基因)突變賦予其Tuner菌株的優(yōu)點(diǎn)——IPTG以均一速度進(jìn)入體系中大腸桿菌的每個(gè)細(xì)胞，產(chǎn)生更加嚴(yán)格、均一的濃度依賴。 pRARE賦予其Rosetta菌株的優(yōu)點(diǎn)——補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子(AUA, AGG,AGA, CUA,CCC,GGA)對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因的表達(dá)水平。 gor522::Tn10 trxB賦予其Origami菌株的優(yōu)點(diǎn)——突變的硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase) (trxB)和谷guang甘肽還原酶(glutathione reductase) (gor)基因，它們是還原途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，其突變有利于高效形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增強(qiáng)蛋白的可溶性。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3 區(qū)(DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA 聚合酶)適合T7 啟動(dòng)子誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)。＊ Rosetta-gamiB(DE3)菌株具有卡na霉素，lu霉素，四環(huán)素抗性，由特殊工藝制作，經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率高達(dá)108 cfu/μg DNA。

操作說(shuō)明

1、Rosetta-gami B(DE3)菌株感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA并用手撥EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。 

3.向離心管中加入700 μl不含抗生素的無(wú)菌2YT或LB培養(yǎng)基，混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。

4.5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含所選質(zhì)粒篩選抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

1、感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4.誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選（0.1-2 mM均可）。

5.為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。