K599 Chemically Competent Cell  發(fā)根(熱激)感受態(tài)細(xì)胞

基因型：

Agrobacterium rhizogenes (strR ) pRi2659 (agropine type)

簡(jiǎn)要說(shuō)明：

發(fā)根農(nóng)桿菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細(xì)菌，它能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物以及個(gè)別裸子植物。K599發(fā)根農(nóng)桿菌（NCPPB2659）含有pRi2659農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒，具有廣泛的宿主范圍（葫蘆科，豆科，茄科等），同時(shí)具有l(wèi)ian霉素抗性。K599化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pCAMBIA2301質(zhì)粒（ka那霉素抗性）檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效>103 cfu/μgDNA

操作說(shuō)明：

一：取-80℃保存的Ar A4發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰中。

二：每100μl感受態(tài)加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（轉(zhuǎn)化效率較高，第一次使用前最好做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量），用手快速、劇烈bo打管底混勻或用槍吹吸混勻，依         次放于冰中靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

三：冰浴中拿出放室溫，加入700μl 無(wú)抗生素的TY 液體培養(yǎng)基，于 28℃振蕩培養(yǎng) 2小時(shí)。

四：6000 rpm 離心一分鐘收菌，留取 100 μl 左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的 TY平板上，倒置放于 28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2-3 天

注意事項(xiàng)：

一：加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

二：混勻質(zhì)粒時(shí)應(yīng)用手指快速bo打管底或用槍吹吸混勻，務(wù)必使質(zhì)?？焖佟⒕鶆蚍稚㈤_，與感受態(tài)細(xì)胞充分接觸。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌             量。

三：平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)不足，陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量或降低涂板的菌量。

四：K599具有l(wèi)ian霉素抗性，不可用于具有l(wèi)ian霉素抗性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。

備注：

1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：

2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

3、TY配方（1L）：

Tryptone 5gYeast extract 3g補(bǔ)水到1L體積，wan全溶解后，121度、20分鐘高溫滅菌配制1M的氯化鈣水溶液，121度、20分鐘高溫滅菌每1L 滅菌的TY液體營(yíng)養(yǎng)液中加入10ml 無(wú)菌的1M氯化鈣水溶液即可。若配制TY固體培養(yǎng)基，則加入15g 瓊脂粉